农杆菌转化法

      农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞），并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

      根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 科研人员将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

     选择一种特制的空质粒载体（如PBI121质粒载体），其上要求含有T-DNA边界序列（此处可参见词条双元表达载体系统），在序列之间含有复制原点、抗性基因、GUS报告基因、Hind Ⅲ和BamH I 等酶切位点（以上这些构成了一个T-DNA区）。先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。我们称这段T-DNA区为目的片段。农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统，由两种质粒组成，一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒，另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口，通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区（目的片段）的反式作用激活T-DNA的转移（此处可参见词条双元表达载体系统），从而将目的片段整合到植物细胞基因组中。随着愈伤组织的形成，使得新生细胞均含有该目的片段的基因。

      转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上——进入农杆菌——导入植物细胞——目的基因整合到植物染色体的DNA上——目的基因得以稳定维持和表达

      1、获取目的基因：用限制性核酸内切酶切割下目的基因。

      2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。

      3、将目的基因导入受体细胞：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。

      4、目的基因的检测与鉴定：用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定（这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。

      5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。

      整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

      在每一步中都涉及到很多的方法与技术。目的载体的构建，包括目的基因的克隆、载体的酶切、连接(用限制性核酸内切酶与DNA连接酶），以及测序分析。载体的农杆菌转化，目前有很成熟的方法，试验中应注意热激和冷激的时间。农杆菌与植株的共培养，即为植株转化实验，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。转化植株的筛选，大多是利用抗生素进行筛选的，抗生素的选择则需根据目的载体确定，设置不同梯度的抗生素对植株进行筛选。转化植株的鉴定，一般采用PCR法。以上所有的操作，都应该在无菌环境下进行，无菌是植物组培的一项基本，但是重要的要素。

      农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点：   ①该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好； ②农杆菌Ti质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛； ③农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料； ④农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。

      农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。它是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。