微生物育种

DNA Suffering技术

　　随着PCR技术的发展和应用，1994年美国的stemmer提出了一个全新的人工分子进化技术——DNA Suffering(又称洗牌技术），该技术能模拟生物在数百年间发生的分子进化过程，并可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百倍甚至上万倍的功能性突变基因。其基本原理是将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化 产生随机小片段，由这些小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一个基因拷贝的引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作新一轮的体外重组。一般通过2-3次循环，课获得产物大幅度提高的重组突变体。

自然选育

　　对自然界中的微生物，在未经人工诱变或杂交处理的情况下进行分离和纯化（见微生物的分离和纯化）,然后进行纯培养和测定(见微生物测定法),择优选取微生物的菌种。这种方法简单易行，但获得优良菌种的几率小，一般难以满足生产的需要。

人工选育

　　分诱变育种和杂交育种两种。

诱变育种

　　以诱发基因突变为手段的微生物育种技术。1927年,H.J. 马勒发现X射线有增加突变率的效果；1944年，C.奥尔巴克首次发现氮芥子气的诱变效应；随后，人们陆续发现许多物理的（如紫外线、γ射线、快中子等）和化学的诱变因素。化学诱变因素分为3种:①诱变剂与一个或多个核酸碱基发生化学变化,使DNA复制时碱基置换而引起变异，如羟胺亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基胍、亚硝基甲基脲等；②诱变剂是天然碱基的结构类似物,在复制时参入DNA分子中引起变异，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤和2-氨基嘌呤等;③诱变剂在DNA分子上减少或增加1～2个碱基，使碱基突变点以下全部遗传密码的转录和翻译发生错误，从而导致码组移动突变体的出现，如吖啶类物质和一些氮芥衍生物(ICR)等。诱变育种操作简便，突变率高,突变谱广，它不仅能提高产量，改进质量，还可扩大产品品种和简化工艺条件。如1943年从自然界分离到的青霉素产生菌的效价只有20单位/毫升,经过一系列的诱变育种后，效价已达40000单位/毫升；金霉素产生菌经诱变后,发酵液中又积累了去甲基金霉素;谷氨酸棒杆菌1299经紫外线诱变后，有的能产赖氨酸,有的能产缬氨酸,增加了产品的种类；土霉素产生菌经诱变后，选到了能减少泡沫的突变菌株，从而提高了发酵罐的利用率。诱变育种的不足是缺乏定向性。

杂交育种

　　不同基因型的品系或种属间，通过交配或体细胞融合等手段形成杂种，或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂种或重组体或是它们的后代中筛选优良菌种。通过这种方法可以分离到具有新的基因组合的重组体，也可以选出由于具有杂种优势而生长旺盛、生物量多、适应性强以及某些酶活性提高的新品系。杂交育种的方式因实验菌株的生殖方式不同而异，如有性杂交、准性重组、原生质体融合、转化、转导、杂种质粒的转化等；但是，选择亲株、分离群体后代的培养、择优去劣和杂种遗传分析的过程基本是相同的。杂交法一般指有交配反应的菌株进行交配或接合而形成杂种。这种方法适用范围很广，在酒类、面包、药用和饲料酵母的育种，链霉菌和青霉菌抗生素产量的提高，曲霉的酶活性增强等方面均已获得成功。

体细胞融合是在不具性反应的品系或种属间细胞融合和染色体重组，先用酶溶解细胞壁,再用氯化钙-聚乙二醇处理原生质体，促使融合，获得杂种。此法在工业微生物的菌种改良中有积极作用。

转化和转导首先应用于细菌，现已广泛用于链霉菌和酵母菌等。随着重组DNA技术的发展,重组质粒的构建和转化系统的确立，已可将目的基因转移到受体细胞内，得到能产生具有重要经济价值的生物活性物质（如疫苗、酶等）的株系。

微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切, 其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏,甚至影响人们的日常生活质量,所以培育优质、高产的微生物菌株十分必要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导, 或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状, 人为地使某些代谢产物过量积累,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前,国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。此外,原生质体诱变技术已广泛地应用于酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素等的菌种选育中,并且取得了许多有重大应用意义的成果。

诱变育种

　　1.1物理诱变

1.1.1紫外照射

紫外线照射是常用的物理诱变方法之一, 是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰在260nm, 因此在260nm 的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释,但比较确定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对,所以可能导致突变甚至死亡[2]。

紫外照射诱变操作简单,经济实惠,一般实验室条件都可以达到,且出现正突变的几率较高,酵母菌株的诱变大多采用这种方法。

1.1.2电离辐射

γ- 射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一,具有很高的能量,能产生电离作用,可直接或间接地改变DNA 结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基,或者脱氧核糖的化学键和糖- 磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使水或有机分子产生自由基, 这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化,导致DNA 分缺失和损伤[2]。

除γ- 射线外的电离辐射还有X- 射线、β- 射线和快中子等。电离辐射有一定的局限性,操作要求较高,且有一定的危险性,通常用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。

1.1.3离子注入

离子注入是20 世纪80 年代初兴起的一项高新技术,主要用于金属材料表面的改性。1986 年以来逐渐用于农作物育种,近年来在微生物育种中逐渐引入该技术[3]。

离子注入时,生物分子吸收能量,并且引起复杂的物理和化学上的变化,这些变化的中间体是各类活性自由基。这些自由基,可以引起其它正常生物分子的损伤,可使细胞中的染色体突变,DNA 链断裂,也可使质粒DNA 造成断裂。由于离子注入射程具有可控性, 随着微束技术和精确定位技术的发展,定位诱变将成为可能[4]。

离子注入法进行微生物诱变育种, 一般实验室条件难以达到,目前应用相对较少。

1.1.4 激光

激光是一种光量子流,又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用,直接或间接地影响有机体,引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化,以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用, 都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。不同种类的激光辐射生物有机体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同[5]。

激光作为一种育种方法,具有操作简单、使用安全等优点,近年来应用于微生物育种中取得不少进展。

1.1.5 微波

微波辐射属于一种低能电磁辐射, 具有较强生物效应的频率范围在300MHz~300GHz,对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升。从而引起生理生化反应;非热效应指在微波作用下,生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下,生物体会产生一系列突变效应[6]。

因而,微波也被用于多个领域的诱变育种,如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种,并取得了一定成果。

1.1.6 航天育种

航天育种,也称空间诱变育种,是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间, 利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异,再返回地面进行选育,培育新品种、新材料的作物育种新技术。空间环境因素主要有微重力,空间辐射,以及其它诱变因素如交变磁场,超真空环境等,这些因素交互作用导致生物系统遗传物的损伤,使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。

航天育种较其它育种方法特殊, 是航天技术与微生物育种技术的有机结合,技术含量高,成本高,个体研究者或一般研究单位都难以实现,只能与航天技术相结合,由国家来完成。

化学诱变

　　2.1.1 烷化剂

烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应,引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异, 常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。

甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulphonate ,EMS) 是最常用的烷化剂,诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，该物质具有强烈致癌性和挥发性,可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。

N- 甲基- N'- 硝基- N- 亚硝基胍( NTG) 是一种超诱变剂,应用广泛,但有一定毒性,操作时应该注意。在碱性条件下,NTG 会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2 对DNA 的烷化作用引起的[2]。

硫酸二乙酯( DMS) 也很常用,但由于毒性太强,目前很少使用。乙烯亚胺,生产的较少,很难买到。使用浓度0.0001%~0.1%,高度致癌性,使用时需要使用缓冲液配置。

2.1.2 碱基类似物

碱基类似物分子结构类似天然碱基,可以掺入到DNA 分子中导致DNA 复制时产生错配,mRNA 转录紊乱,功能蛋白重组,表型改变。该类物质毒性相对较小,但负诱变率很高,往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶( 5- FU) 、5- 溴尿嘧啶( 5- BU) 、6- 氯嘌呤等。程世清等[25]用5- BU 对产色素菌( 分枝杆菌T17- 2- 39) 细胞进行诱变,生物量平均提高22.5%.

2．1.3 无机化合物

诱变效果一般,危险性较小。常用的有氯化锂,白色结晶,使用时配成0.1%~0.5%的溶液, 或者可以直接加到诱变固体培养基中,作用时间为30min～2d。亚硝酸易分解,所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取,将亚硝酸钠配成0.01~0.1mol/L 的浓度, 使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。

2.1.4 其他

盐酸羟胺,一种还原剂,作用于C 上,使G- C 变为A- T。也较常用,使用浓度为0.1%～0.5%,作用时间60min～2h。

此外,诱变时将两种或多种诱变因子复合使用,或者重复使用同一种诱变因子,效果更佳。顾正华等[7]以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株,经DMS 和NTG 多次诱变处理,获得一株L- 组氨酸产生菌。

2、诱变剂

2.1 诱变剂的选择

在选择诱变剂时, 需要注意诱变剂的专一性, 即某一诱变剂或诱变处理优先使基因组的某些部分发生突变而别的部分即使有也很少发生突变。对诱变剂专一性的分子基础不十分了解万尽管有关的修复途径必定对此有影响, 但它们的关系并不那么简单, 其它各种因素,包括诱变处理的环境条件也能影响突变类型。

工业遗传学家很难正确地预言改良某一菌种时需要何种类型的分子水平的突变。因此, 为了产生类型尽可能多的突变体, 最适当的方法是采用几种互补类型的诱变处理。远紫外无疑是所有诱变剂中最为合适的, 似乎可以诱导所有已知的损伤类型。采取有效、安全的预防方法也很容易。在化学诱变剂中, 液体试剂比粉末试剂更易进行安全操作。的另一个不利因素是它有产生紧密连锁的突变丛的趋势, 尽管这种效应在某些体系中能成为有利条件。最后, 必须认识到可能某些特异菌系用某些诱变剂是不能被诱变的。当然这一点通过测定易检出的突变体, 如抗药性突变体或原养型回复突变体的诱变动力学可以相当容易地得到验证。[8]

2.2 诱变剂的剂量

从随机筛选的最佳效果看, 诱变剂的最适剂量就是在用于筛选的存活群体中得到最高比例的所需要的突变体, 因为这会使在测定效价的阶段更省力。

因此在菌株改良以前,为了决定所用诱变剂的最适剂量, 并为突变性的增强技术打下基础, 聪明的做法通常是测定不同诱变剂处理不同菌种时的突变动力学。用高单位突变本身来测定最适剂量有时是不可能的, 因为这种突变的检测很困难。但如使用容易检出的标记如耐药标记, 只要估计到方法的局限性, 还是可以提供一些有价值的资料的。[9]

原生质体诱变在工业微生物育种中

　　的应用进展

3.1 在酶制剂菌种选育中的应用

酶制剂是活的有机体产生的有催化活性的蛋白质,是所有新陈代谢过程必不可少的要素。应用原生质体诱变技术对酶制剂的生产菌株进行诱变,已经获得了许多高产菌株。

胡杰等[10 ]对沪酿(Aspergillus oryzae) 31042米曲霉的原生质体进行紫外线-氯化锂、N-甲基- N′-硝基-N - 亚硝基胍( N - methyle - N′- nitro - N -nitrosogunidinc, NTG)复合诱变,筛选到8 株高产中性蛋白酶突变株群,其中最高产酶活力为出发菌株的1162倍,为以后的细胞融合、基因组改组等提供了优良的候选文库。

3．2抗生素高产菌种选育中的应用

抗生素是微生物细胞的次级代谢产物,目前主要采用微生物发酵法进行生物合成。由于生产菌种产量的高低受多步代谢调控的制约,高产菌株的选育也很困难。原生质体诱变作为一种诱变技术,在抗生素的高产菌种选育中已有着广泛的应用。

朱林东等[ 11 ] 通过紫外线诱变始旋链霉菌( S treptom ycespristinaespiralis)的原生质体, 得到了产普那霉素为1159g/L的高产突变株,比出发菌株提高10113%。

3.3 在氨基酸、生产溶剂及有机酸菌种选育中的应用

氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位,在食品、饲料、医药、化学工业、农业等行业中应用广泛,各国都在大力发展氨基酸生产。发酵法已成为氨基酸生产的主要方法。因此选育高产菌株是氨基酸工业发展的重要方向。

生产溶剂和有机酸是微生物的初级代谢产物,原生质体诱变技术在生产溶剂和有机酸生产菌种选育中也取得了成效。

3.4 生素菌种选育中的应用

维生素是维持人和动物生命活动必需的、但不能自身合成的一类有机物质,在生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。韩建荣等用激光处理青霉( Penicillium sp) PT95 的原生质体,选育到一株菌核生物量和类胡萝卜素含量均有显著提高的突变株L05。该突变株的菌核生产量提高98.6% ,菌核中的类胡萝卜素含量提高28.3% ,类胡萝卜素产率的增加幅度达到154.0%。

3.5 虫菌种选育中的应用

苏云金杆菌(B acillus thuringiensis)是从自然界中筛选出来的一大类细菌型微生物杀虫剂,多应用于农林害虫的防治中。王丽红等[ 12 ] 对苏云金杆菌NU- 2的原生质体进行紫外线-氯化锂复合诱变,筛选到的突变株发酵周期从44h缩短到40.3h,晶体蛋白含量提高10.03%。

展望未来

　　近年来,随着新的诱变源的出现,原生质体诱变技术的应用也会有新的进展。离子束作为一种新的诱变源,有其特有的作用机理[ 13 ] ,使得离子束诱变具有诱变谱广、变异幅度大、突变率高等优点,其应用也取得了很多重要的成果,特别是运用离子注入选育Vc菌株的成功,为我国的VC 行业增添了活力。航天搭载的微生物菌种,能借助微重力、空间辐射、超真空等综合空间环境因素的转换,在较短时间里创造目前其它育种方法难以获得的罕见基因突变,以此来进行微生物育种是空间技术育种的一个重要的应用领域。利用空间技术对某些抗生素的产量提高及酶制剂研究曾有些可喜的结果。将离子注入、空间技术与微生物原生质体技术结合起来,微生物原生质体诱变技术将会有更加广阔的应用前景。

结语

　　随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展, 许多新型复杂的技术被应用于菌种选育, 如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等, 但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高,可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面,诱变育种存在一定的盲目性和随机性,在实际应用中,研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。本实验室将物理因子和化学因子结合起来对多种酵母菌株进行复合诱变,均得到了理想菌株。此外,我们正在尝试反复采用几种诱变因子进行多次诱变,以期得到更为理想的菌株。

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