土壤微生物

生态学研究方法进展

土壤微生物研究方法经历了微生物纯培养、土壤酶活性（BIOLOG微平板分析）、微生物库（如微生物生物量）和流（C和N循环）、微生物生物标记物（FAMEs）、微生物分子生物学技术（从土壤中提取DNA，进行PCR-DGGE、PCR-SSCP、RLFP分析等），揭示了土壤微生物群落丰富的多样性和生态功能；现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为土壤微生物学研究提供较好的前景。

土壤微生物学最本质的问题是微生物生态学的问题。本文旨在对这领域的研究作个回顾，介绍一些新方法，对将来土壤微生物研究作出展望。

1 微生物纯培养

传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。随着人们对土壤中微生物的原位生存状态研究，越来越发现常规的分离培养方法很难全面地估价微生物群落多样性。从土壤中简单提取和平板培养计数不能得到土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息。纯培养方法和原理大多从医药微生物引过来的，有些方法对土壤微生物研究并不很适合，譬如在自然土壤生态环境下许多土壤微生物处于贫营养，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤活细菌的总数，大量的贫营养微生物不适宜生长，测定结果误差大；一般实验室在分离培养土壤细菌时通常只是在28 ℃下培养。尽管土壤中存在高温型细菌，但土壤中的低温型细菌则被忽视了。由于传统的平板培养方法只能反映极少数微生物的信息，这些研究不能充分了解土壤微生物生态功能，也埋没了大量有很大应用价值的微生物资源。

2 土壤酶

用生物化学技术能快速地检测土壤酶活性，使土壤酶学研究在60年代后期至80年代比较热门，其中尿酶、磷酸酶、脱氢酶在土壤中的含量和变化规律研究较多。但土壤酶测定方法用于土壤微

生物研究的一个致命弱点是不能直接的反映土壤实际微生物状况。Visser 等对酶检测用于土壤微生物群落和土壤质量评价提出了怀疑。Skujins(1978)认为脱氢酶本身的生物化学特征决定了它不可能以胞外酶状态存在于土壤中。为了解决土壤酶测定中的评判问题，Beck（1984）提出了土壤微生物如微生物量（microbialbiomass）、还原酶（reductase）、水解酶（hydrolase）的适宜指标，然而，这些指标从来没有被广泛采用。Beck（1984）和Trasar-Cepeda et al.（1998）认为把酶用于土壤质量评价指标是值得怀疑的，而且缺乏常规可行的酶测定手段，存在药品昂贵等问题^[7，8]。

Community-level physiological profiling (CLPP)是由Garland and Mills （1991）提出的另一种酶分析方法，微生物群落降解95种不同单一碳源的能力可一次分析，其中BIOLOG GN微平板较多应用于研究土壤和环境微生物区系。作者采用BIOLOG GN微平板培养分析施用生态有机肥对土壤微生物多样性和番茄青枯病的影响，结果表明，连作地施用生态有机肥后，番茄青枯病显著降低，土壤微生物多样性显著提高。由于真菌、放线菌的代谢反应不能分解四氮叠茂，此方法只能检测微生物群落细菌（主要是革兰氏阴性菌）中快速生长的那部分微生物信息。不同的微生物对同一碳源的利用能力是有差异的，微生物对不同单一碳源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对碳底物实际利用能力的

改变，同时在温育过程中存在适应性问题如代谢补偿、代谢适应等。但CLPP方法因快速、简便而受到人们的欢迎，因而有专用于土壤和环境微生物生态研究的生态微平板（EcoPlates）（Insam，1997）。土壤酶测定方法至今没有一个标准的参数和测定标准，不能对土壤微生物生态功能一个准确的答案，若要充分分析土壤特征，了解不同土壤之间的差异，一定要与其他的方法相配合。

3 流（fluxs）

土壤微生物是土壤生态系统中库（pool）和流的一个巨大的原动力。土壤酶测定一般要在适宜的条件下测定，不能作为土壤物流的原位评价。库和流的计算对土壤微生物学家来说很重要，测定土壤微生物呼吸（CO₂的释放量），是较好的微生物群落总代谢活性指标。

N、NO₃输入引起土壤酸化，甚至引起地下水的N污染。氮的分配（N₂O、NO等）对气候变化和臭氧层破坏有极大影响，生物固氮对缓解矛盾有重要的意义，同时也提高农作物产量和减少人类饥饿。从1970年以来，共生和非共生固氮研究很热烈。土壤微生物学家应用分子生物学技术在转基因作物和转基因工程菌方面研究，大大提高了生物固氮效果。许多传统方法，如N矿化测定，硝化潜力或用于反硝化测定的乙炔抑制方法仍然广泛使用。应用¹⁵N放射性标记方法可详细地了解土壤中或土壤微生物群落中的N分配和去向。

土壤具有复杂的空间异质性，大多数养分流测定方法不适于田间测定，局限于实验室模拟，目前有较好的地理信息系统软件来统计和分析这些数据。Bruckner等（1999）测定土壤理化和生物指标，研究了温带松果类森林土壤的的空间差异，发现土壤中某些养分转化过程需要在一定的生态点进行，如仅在一定团粒粒级范围内进行。Rasiah等（1999）研究发现不同农业措施会引起土壤紧实度、质地和有机质特性变化。Stenberg等（1998）研究26种不同性质土壤的微生物状况，也证明土壤有巨大的异质性。

4 库(pools)

在生物地球化学循环中，常用“库”表示物质在生态系统中的滞留，生物量（如植物根系和动物区系生物量）和其它有机物（动植物凋谢物，土壤有机质）都是土壤生态系统最重要的“库”。土壤微生物生物量和土壤微生物区系、土壤呼吸强度、

土壤酶活性、土壤微生物多样性等，常被研究者进行比较研究。随着研究的深入，土壤学者发展了一系列的土壤微生物量测定方法，如直接镜检法、ATP分析法、熏蒸培养法、熏蒸提取法、底物诱导呼吸法。其中直接镜检法是在显微镜下计数一定面积下的微生物个数、体积及密度（一般采用1.18 g/cm³），计算出单位干土质量中所含的微生物生物量。该法的主要缺陷是技术难度大，误差大，操作复杂、不适合批量分析。Jenkinson（1976）提出了一种间接微生物量测定方法，即氯仿熏蒸杀死和溶解土样中微生物，重新培养土壤10 d，然后测定土壤呼吸。根据熏蒸与未熏蒸土样释放CO₂量的差值，计算土壤微生物量C，此方法称为熏蒸培养法（fumigation–incubation，FI）。但测定要花10 d，不适用于风干土样，对钙质土、淹水土壤，其结果均不可靠。Brookes et al.（1982，1985）提出了一种更直接的估计微生物P、N的方法（FE），土样经氯仿熏蒸后，用硫酸钾溶液浸提，从而测定微生物P、N，也可测定微生物C、S。此方法是目前较好的微生物量测定方法，FE方法针对不同的土壤、不同的要素制定不同的参数，这些参数的确定要慎重。此方法适合批量测定，适用土壤范围广，但值得一提的是熏蒸后氯仿必须被抽尽，否则，氯仿本身的C素被作为微生物C提取，使结果偏高。Anderson and Domsch（1978）提出了另一种微生物分析方法——底物诱导呼吸方法（substrate-induced respiration，SIR），此方法起源于纯培养研究，微生物对易利用底物的反映强度与微生物量存在线性关系，可用于土壤微生物量的测定。但计算参数目前还存在争议。目前FE和SIR方法作为一些国家（如德国）土壤普查的标准方法。

生态系统演替过程中的能量最优化性是生态系统进化的Odum理论的主要精髓（Odum，1969），根据此理论，系统的成熟程度增加，生态系统的呼吸效率/生物量的比值随之相应降低。既然所有初级生产力C最终都进入土壤C库，土壤微生物库的大小可作为土壤质量的一个可靠指标；可用于土壤长期和短期的养分动力学研究，其中微生物生物量是强有力的指标，它具有快速、重复性好等优点；可通过微生物总量比较而认识农业措施和污染对土壤质量的影响；但它仍存在缺陷，只能反映部分功能和专性微生物，在一定程度上土壤生态系统物流能流或者微生物群落库的组成需进一步详细调查。

5 生物标记物（biomakers）

尽管企图测定库和流来反映土壤微生物状况，但土壤及其微生物仍是一个黑箱，只有少量的窗口（如可分离、培养、鉴定的微生物）打开，其微生物总量和物流的决定因子还不清楚。不同的生物体，其细胞壁和原生质的组成成分不一样，通过测定土壤中某些特有成分的含量，就有可能估价出土壤中微生物的生物量，如Jenkinson and Ladd指出，所测定的成分必须符合4个条件，才能用于估算土壤微生物量：①该成分存在于土壤所有的微生物体内，而且其浓度能确切地知道，并且不随生长时期而改变；②该成分仅存在于活的细胞内，细胞死后该成分迅速被分解；③该成分能被定量地提取出来；④并能被准确地测定出来。目前用于估计土壤微生物量有许多方法，但能够完全符合以上条件的微生物细胞成分几乎没有。不过它与其他方法比较，能直接测定土壤中某些物质的含量，粗略估计微生物量，是简便快速的方法，而且适合批量分析。

West（1987）报道土壤麦角固醇含量作为真菌的定量指标，麦角固醇是大多数子囊菌类、担子菌类、真菌类中主要的固醇，因而作为真菌生物量的标记物，但近年来受到Ruzicka等的争议，他们发现麦角固醇虽然在一定程度上反映了土壤真菌的定植情况，但作为真菌微生物量的主导变化因子还没有认清楚。胞壁酸与麦角固醇相反，目前仅在原核生物体中发现，可作为细菌和蓝藻类生物量标记物，但不同土壤的提取参数是不一样的，有人怀疑胞壁酸主要保留在死细胞中，其应用受到限制。土壤ATP分析方法，也存在很大争议，主要原因在于不同土壤微生物组分的ATP浓度不一定一样，单位微生物生物量所含有的ATP不一定相同，目前所报道的土壤微生物量C的ATP浓度从3~30 mmol/g，但90%以上在6~15 mmol/g之间，其平均值为11。

对微生物学者来说，仅区分细菌和真菌是不够的，因为这样忽视了许多微生物种类和功能性亚种。应用磷脂类化合物的脂肪酸组成来研究微生物群落结构是近几年来发展的一种新方法，磷脂类化合物只存在于所有生物细胞膜中，一旦生物细胞死亡，其中的磷脂类化合物马上消失，生物中的磷脂类化合物能显示出快速转换率，而且生物可以把相对稳定的磷脂类化合物作为它们的生物量，磷脂类化合物的这些特性和磷脂类化合物与生物的密切关系，可用作土壤中微生物群落结构指纹分析，为土壤微

生物群落结构的研究提供了一个较简便、准确的方法^[21，23~25]。脂肪酸甲脂分析方法（fatty acid methyl esters，FAMEs）中应用较多的有PL-FAMES（Phospholipid linked-FAMEs）和EL-FAMES（Esters linked-FAMEs），后者与前者比较起来，不需要氯仿和硅胶树脂色谱柱，样品提取简单、快速，对人体安全。作者用EL-FAMES分析生态有机肥对土壤微生物群落多样性和番茄青枯病的影响，发现施用生态有机肥对番茄青枯病的防治作用最好的能达61.6%，同时改善土壤微生态系统结构，提高了土壤微生物多样性。

细菌和真菌可根据其磷脂组成来鉴别，FAME分析法为种内关系的建立提供了一个快速而可靠的方法，但不同属甚至不同科的微生物的FAME有可能重叠，因此在区分关系较远的微生物应用上有一些困难。但以FAME的多样性来表示一个不太复杂的生态系统的生物多样性仍有一定的参考价值。在应用中要考虑微生物中磷脂能否提取完全、稳定，同时微生物的新陈代谢状态决定不同生物标记物组分的比例。总之，如果没有更好的方法选择，生物标记物测定方法也可行，但在将来，生物标记物测定方法逐渐被分子生物学方法所取代。

6 分子生物学技术

Torsvik于1980年从土壤中提取DNA，1990年用DNA/DNA杂交技术研究发现，1 g土壤中有4000个以上不同的细菌种类，说明存在大量的多态性^[26，27]。目前从土壤中抽提DNA的方法有两种：（1）反复的悬浮、离心以提取细胞，然后溶解细胞，抽提总DNA；（2）用机械破碎、化学、酶解的手段直接裂解土壤微生物细胞，释放DNA。第一种方法提取DNA的纯度比第二种方法要高，但提取量少，不能反映整个微生物群落，而且费时费力。第二种方法接近土样的实际情况，操作流线型，可批量的作业，但腐殖物质类的杂质非常多。细胞溶解效率、核酸纯化的效率和程度、核酸提取的数量、土壤DNA提取的数目多少取决于细胞的溶解强度，但土壤中有些细菌特别是许多GP细菌很难溶菌裂解；在抽提过程中要注意防止DNA断裂和降解，抽提的DNA不能小于1 kb，这样容易促成PCR扩增失败或假阳性，应根据研究目的选择适当的DNA抽提方法。目前土壤DNA纯化的手段很多，如沉淀、层析树脂（阳离子交换、疏水性交换树脂等）、玻璃珠吸附、琼脂糖电泳等方法，纯化时间约4~12

h。虽然土壤DNA提取、纯化的速度和效率研究有大大的进展，但还是有许多问题，因为大多数DNA纯化方法针对特定的土壤条件是适宜的，但不同土壤的物理、化学性质是高度异质的，任何方法不是通用于所有土壤。土壤DNA提取、纯化的方法有待进一步完善。

许多方法用来研究土壤DNA或RNA，其中原核生物的16S rDNA区域应用较多，它具有保守序列和高变异性序列等优点，它的长度为1500核苷酸。目前，16S rRNA基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究，16S rRNA基因序列分析是主要基于已建立的微生物16S rRNA基因序列数据库，用以确定细菌的系统发育关系，序列探针用于识别不可培养菌（uncultured microbes）。另外，从土壤中分离总微生物DNA，用特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增产物可用凝胶电泳来分析，从而可在种的水平上探讨微生物之间的内在联系。变性梯度凝胶电泳（DGGE）是应用得较多的，它可根据PCR扩增产物中不同G+C含量的rDNA组分在电泳胶中的移动位置不一样，直接反映rDNA多态性，低G+C含量的组分在电泳胶中变性快些、在胶中的移动速度较慢，因此不同的G+C含量在胶中产生不同带，不同微生物群落的带型组成不一样，这样可直接观察不同微生物群落多态性。即使是大小相同，但序列有差异的DNA片段，在变性剂梯度凝胶中电泳时，由于DNA双螺旋结构分离的情况不一样，在胶中的移动速度不同，也可得到分离，也可把DNA片段切下来，进行克隆、测序，和已知菌种比较，许多研究者发现有很多的被测序列和数据库中任何已知序列都不匹配，很可能是不可培养的微生物新种。RFLP分析是另外一种微生物分子生态学分析方法，对PCR扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳，然后用标记探针杂交，来揭示微生物RFLP的多样性。Schwieger and Tebbe（1998）提出的single strand conformational polymorphism，（SSCP）方法可研究G+C含量相同但序列不同的DNA。然而这些方法对土壤微生物的研究是定性的，土壤微生物的定量PCR分析方法是非常麻烦、需要进一步的改进。

7 应用前景

新技术的发展，特别是分子技术的引进为土壤微生物学家展示了研究土壤微生物组成、活性和原位研究的美好情景。原位杂交能显示土壤微生物是否存在，甚至阐明微生物活动的区域。微生物活动

的热点（Hot spots）是将来要着重研究的。

应用Microarray 技术能较快估计土壤微生物群落多样性。另外可用信使RNA（mRNA）来阐明土壤微生物结构与功能的关系。虽然mRNA研究有许多优点，但它的半衰期非常短，目前的技术手段还不可能作充分的研究，将来mRNA研究与PCR特异性扩增技术相结合，其效果比任何酶测定方法都要好，它能提供各个阶段的代谢信息。mRNA研究与rDNA分析相结合，能获得在某种代谢状态下的某种微生物种群的精确信息。土壤不再是黑箱，而是一个可以看得见的、摸得着的系统，在许多年以来土壤微生物学家所面临诸多问题可以解决了。土壤管理者可根据实际情况，通过各种措施，有目的的调理土壤微生物数目和种类，制定农业生产措施；也可以根据土壤微生物客观条件制定耕作制度。通过改进施肥、栽培制度、人为引入有益的土壤微生物等措施，来恢复原有的微生物群落或增加某些功能，从而抑制作物土传病菌、提高土壤微生物多样性，有助于土壤生态肥力的提高，从根本上防治作物土传病害、连作障碍。

大多数土壤微生物未知种群蕴藏着目前还无法估量的资源。从土壤微生物资源中分离筛选、开发出功能微生物，将是今后应该加强研究的重要工作。

微生物群体对环境状况的反应变化，可作为一个地区或历史环境变迁的生物指标，土壤微生物可用于监测环境变化方面的研究。微生物在高等生物的保护和恢复生物学中起重要作用，如菌根真菌可帮助植物成功地将根定植在土壤中，从而实现本地区的森林再造。微生物在地球上存在的历史悠久，可作为阐明生态和生物进化原理的模式。

分子生态学技术使研究微生物多样性的方法更为直接，这些新技术与传统方法相结合，才有可能对复杂的生态系统中的微生物多样性和群落结构进行分析和研究。通过对微生物生态系的组成，不同个体间的空间关系和种群功能间的相互关系的原位测定，可以预见，土壤微生物生态学研究将为我们展示一个革命性的前景。