由蜡样芽孢杆菌引起的细菌性白斑病是南美白对虾半精养出现的新型疾病

　　由蜡样芽孢杆菌引起的细菌性白斑病是凡纳滨对虾半精养出现的新型疾病

　　S. Velmurugan（印度，2015年）

　　摘要
     
　　在印度南美白对虾养殖业现在正面临着一个严重的新型细菌病，即白斑病（WPD）。感染疾病后，死亡率随着感染天数逐渐增加。但是一旦严重的疾病暴发来临，养殖场南美白对虾的死亡率在3-5天内将超过70%，主要症状是头胸甲上有不透明的白色斑块、坏死、体色淡蓝、食欲不振、肌肉发白。对染病的虾进行革兰氏染色，发现病原体是杆状菌。基因组鉴定证实，WPD的致病病原菌为蜡样芽孢杆菌（GenBank登录号：KF673474.1）。引起WPD的蜡样芽孢杆菌具有较高的致病因子包括溶血活性、脂肪酶活性。南美白对虾和卤虫在细菌浓度为10的4次方到8次方cfu/mL时，死亡率较高。
 
　　1、前言
     
　　印度的对虾产量主要来源于斑节对虾，2004年产量为125000吨，但2008年迅速下降到75000吨。产量的下降主要是由斑节对虾的繁育和疾病问题导致的，且其种质的衰退也促使印度政府从太平洋地区引进无特定病原******的南美白对虾。因为它被报道具有高抗病性，高生长速度，对高密度的持续耐受性强，适应低盐低温(Remany et al., 2010)。养殖户通过养殖南美白对虾已经取得了巨大成功并获得了高利润，这使得南美白对虾成为了一个重要的从国外引进的养殖物种（Palanikumar等，2011）。
 不幸的是，在印度的内洛尔牛、普拉喀桑县、Gundur、克里希、西戈达瓦里河、东戈达瓦里区的安得拉邦、纳格伯蒂讷姆、Sirkali、Cudalore、韦兰卡尼、泰米尔纳德邦的Pudukottai和Poneri区，南美白对虾养殖场正面临一个严重的新型的细菌性疾病。在对虾的养殖过程中染病后，随着养殖天数的增加，死亡率慢慢增加。一旦爆发，虾的存活率很低，FCR较高。有时当疾病爆发后，南美白对虾在2-3天内会出现非常严重的死亡，使得养殖户不得不提前清塘，对养殖户造成了重大经济损失。最重要的症状为：尾部横纹肌和腹部肌肉组织坏死；坏死的区域表现为白色不透明的斑块。之后，白色的斑块变成黑色斑点或者碎片；虾体色变成淡蓝色；食欲不振；有时候体表粗糙，体色变红或不变色；肌肉发白。许多死虾显示，其外部骨骼完整，但内部组织却缺失了很多，就好像是被吃了或者是内部退化造成的。在疾病急性发生期，南美白对虾的死亡率高达70%。
 
　　组织学和基因组鉴定结果表明，该白斑病的病原体为革兰氏阳性杆状细菌—蜡样芽孢杆菌。几个蜡样芽孢杆菌菌株已经被确定为不同食物中毒类型的病原体(Ehling-Schulz et al., 2004)。目前的工作目的是确定和描述养殖南美白对虾白斑病（WPD）新的细菌病原体。
 
　　2、材料和方法
 
　　2.1 南美白对虾样品
　　濒死的虾来自安德拉邦的Tanuvtur、Prakasam区域的半精养虾场，其死亡是由细菌感染引起的。濒死的虾在无菌的条件下，用无菌的聚乙烯袋装充氧的养殖池塘水，其水温为26±28°C，在一小时内送到安德拉邦的翁戈尔区域的实验室内。濒死虾的主要症状：甲壳有白色不透明的斑块，坏死，体色淡蓝色，食欲不振，肌肉发白。
 
　　2.2 疾病爆发时的水质和理化参数
　　对发病池塘水取样，对水质参数，包括盐度、溶解氧（DO）、pH值、碱度（alkalinity）、硬度（hardness）、氨氮，按照巴斯卡兰（1964）的标准进行分析，如表1。


　　2.3 细菌分离
 
　　2.4 筛选WSSV
 
　　2.5 致病因素
　　2.5.1 累积死亡率
　　为了研究致病细菌病原体的毒力，对南美白对虾的仔虾、成虾和卤虫成虫进行病原微生物感染实验。
    2.5.2 细胞外毒力因子
　　蛋白水解活性、溶血活性、明胶酶检测、脂肪酶检测。
    
　　2.6 细菌鉴定方案
    2.6.1 表型鉴定
    2.6.2 虾组织样本革兰氏染色
    
　　2.7 数据分析
　　P≤0.001，显著。

　　3、结果
    
　　3.1 感染虾的病理变化
　　在南美白对虾感染白斑病的前期，每天的死亡缓慢增加，但其摄食率较高。感染虾的临床症状是：（一）尾部横纹肌和腹部肌肉组织坏死；（二）坏死的区域表现为白色不透明的斑块。之后，白色的斑块变成黑色斑点或者碎片；（三）虾体色变成淡蓝色；（四）食欲不振；（五）有时候体表粗糙，体色变红或不变色；（六）肌肉发白；（七）许多死虾显示，其外部骨骼完整，但内部组织却缺失了很多，就好像是被吃了或者是内部退化造成的。在疾病急性发生期，南美白对虾的死亡率高达70%（图1）。

图1 由细菌引起的太平洋南美白对虾白斑病（WPD）大规模爆发，箭头表示甲壳上的白斑。

　　3.2 细菌分离
　　每个池塘均分离出了4个优势菌种，它们分别命名为：池塘-I的为PI-1、PI-2、PI-3和PI-4；池塘-II的为PII-1、PII-2、PII-3和PII-4；池塘- III的为PIII-1，PIII-2，PIII-3和PIII。鉴定知：菌落的PI-3，PII-2和PIII-2具有相同的形态。分离鉴定从每个池塘中挑选10尾虾进行分离（表2）。

右上角标a的蜡样芽孢杆菌在所有筛选出来的虾上均分离出了
　　3.3筛选WSSV
　　对感染白斑病的虾进行DNA的PCR扩增，从三个池塘取样的虾，其结果均为阴性（见表3）。

　
　　3.4 致病因子的研究
　　南美白对虾成虾、仔虾和卤虫感染从白班病中分离的不同细菌，导致的累积死亡率见表4。细菌感染虾和卤虫时，PI-3、 PII-2和 PIII-3能够有效的杀死它们。用PI-3感染仔虾、成虾和卤虫时，其累积死亡率分别为92.4%、100% 和100%。而PII-2感染时，则分别为96.6%、 100 %和 98.50 %。但PIII-2感染时，其死亡率（95％至100％）更高。单因素方差分析结果表明，对虾和卤虫感染，其结果在不同的细菌间差异显著（P≤0.001）。

　　用10 8 cfu /ml 的从白斑病分离的细菌感染仔虾、成虾和卤虫后的累积死亡率。右上表字母相同表示差异不显著（单因素方差分析）。

　　3.5 疑似细菌性病原体鉴定
　　3.5.1 表型鉴定
　　结果表明，被鉴定的细菌（PI-3，PII-2和PIII-2）为革兰氏阳性菌，游动，能够形成内生孢子，对甲基红、过氧化氢酶试验、淀粉水解、氧化酶试验、酪氨酸琼脂和酚红葡萄糖溶液等呈阳性；它们对伏-伯氏检测、吲哚生产、柠檬酸利用率、尿素酶试验和硝酸盐还原等呈阴性。这三株菌株都有分解碳水化合物，抵抗溶酶菌，产生溶血毒素的能力。根据形态、生理生化实验鉴定，确定这三株细菌为同一种蜡样芽孢杆菌（表5）。

　　3.5.2 虾组织样本的革兰氏染色
　　革兰氏染色的结果表明，图2的a和b显示，在感染了白斑病虾的尾部腹肌中可以清楚的看到杆状的革兰氏阳性菌。


40×放大倍数，箭头指示杆状菌

　　3.5.3 基因水平鉴别致病菌病原体
　　NCBI BLAST搜索分析表明，该WPD致病病原体与蜡样芽孢杆菌相符。其16S rRNA基因序列，通过系统进化树分析表明，WPD致病蜡样芽孢杆菌与其它蜡样芽孢杆菌的同源性为98%，如B.cereus IAM。WPD致病蜡样芽孢杆菌与其它同源性较高的蜡样芽孢杆菌依次为Y-TSB18、BAB2832、XX2010，等（图3）。WPD致病蜡样芽孢杆菌序列已经被收录在NCBI数据库了，GenBank中其名称为白斑病（WPD）蜡样芽孢杆菌，登录号为KF673474.1。


　　4、讨论
           
　　2012年，白斑病的危害在印度的南部—安德拉邦发生的很缓慢。到了2013年，它已经蔓延到了安德拉邦的其它区域，包括内洛尔，Prakasam，Gundur，克里希纳， West Kodavari and East Kodavari区域。也蔓延到泰米尔纳德邦的纳格伯蒂讷姆，Sirkali，Cudalore，Velankanni，Pudhukottai区域。目前，在安得拉邦和泰米尔纳德邦的南美白对虾半精养养殖场爆发了该疾病。此前（即2012年），仅在夏季爆发白斑病导致死亡。后来在2014年的冬天和夏天均爆发了此病。另外，在本研究中，白斑病导致的症状中，首先出现的是尾部横纹肌肌肉组织坏死，坏死的区域表现为白色不透明的斑块。之后，白色的斑块变成黑色斑点或者碎片。Wang et al. (2000)做了一些工作，他发现，在马来西亚半岛的斑节对虾养殖场，枯草芽孢杆菌导致了细菌性白班综合症（BWSS）。被感染的虾上面有类似于白班综合症（WSSV）引起的白色斑点，还有大量的杆状细菌存在。
          
　　在本研究中，从三个不同的池塘分离出12株细菌，分别进行毒力研究，以确定南美白对虾的真正致病源。从每个池塘取10尾虾进行WSSV检测，均成阴性。在30尾实验虾中（来自三个池塘），均检测到了芽孢杆菌属的细菌（PI-1，PII-2和PIII-3），后来证实引起白斑病（WPD）的是蜡样芽孢杆菌。实验的结果表明，细菌PI-1，PII-2和PIII-3具有较高的毒力，在3天内能够有效的杀死实验虾和卤虫。对虾肌肉的革兰氏染色结果证实，在WPD病虾横纹肌中有革兰氏阳性杆菌。基于这些结果，细菌PI-1，PII-2和PIII-3被确定为WPD的致病原。Wang et al. (2000)早期的工作也证明，枯草芽孢杆菌导致了斑节对虾的细菌性白班综合症（BWSS），它是通过显微镜和PCR研究确定的。
          　
　　本研究中，PI-1，PII-2和PIII-3具有较高的蛋白水解，溶血，明胶酶和脂酶活性。这表明它们具有裂解虾角质层的能力，其角质层由蛋白，壳多糖，碳酸钙和脂质构成（Branson, 1993;Dennell, 1960）。患WPD的虾，其甲壳上有白色不透明的斑块。之后，白色的斑块变成黑色斑点或者碎片，最后粗糙不平。蜡样芽孢杆菌是一个重要的食源性产肠毒素的致病菌，已经从鱼的样品中分离出来了，并找到了其负责毒力的基因(Das et al.,2009)。枯草芽孢杆菌被报道为分泌多种酶，主要是蛋白酶，淀粉酶，葡聚糖酶和脂肪酶(Formigoni et al., 1997; Shady, 1997)。Hendriksen et al. (2006)证明，土壤沉积物中蜡样芽孢杆菌的丰度存在hlyII基因。在其有天然宿主且温度条件适宜时，hlyII基因表达毒力因子。在我们的研究中，可能是环境条件不利导致的疾病爆发。不利环境下，溶血因子直接通过且表达。Andreeva et al. (2007)指出， hlyII基因表达和作用的最佳温度为15至28℃。hlyII基因它可在甲壳动物体内作用(Sineva et al. 2009)。
          
　　根据表型和基因组水平鉴定WPD的致病病原体（PI-1，PII-2和PIII-3），被确认为蜡状芽孢杆菌，并收录在NCBI数据库（GenBank登录号：KF673474.1）。基于上述的鉴定和分子表征，蜡样芽孢杆菌是普遍存在的杆状内生孢子增殖(De Jonghe et al., 2008)，它广泛存在于环境中，包括土壤和粘土、沙、尘、矿物水、加工过的食品等(Goepfertetal.,1972;Johnson,1984;Norris et al., 1981)。昆虫的肠道被建议为蜡样芽孢杆菌栖息地，其孢子可以在里面萌发成蜡样芽孢杆菌。之后，从土壤节肢动物的肠道内分离并鉴定出了蜡样芽孢杆菌(Margulis et al., 1998)。基于虾组织革兰氏染色、毒力因子、表型、基因组水平鉴定，得出的结果是：导致南美白对虾白斑病WPD的致病原为蜡样芽孢杆菌。