饲料中维生素Ｂ6测定方法

    1 主题内容与适用范围
　　本标准适用于配合饲料，预混合饲料，浓缩饲料中所添加维生素B6的测定。测定范围为0.08～3.5μg/mL。

    2 原理
　　用水提取，在pH7条件下，用荧光法测定维生素B6。

    3 试剂和溶液
　　除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。

    3.1 pH7缓冲液
　　称取29.3023g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，GB 1263）和3.8115g柠檬酸（C6H8O7·H2O），HGB 3296）于100mL容量瓶中，用煮沸后冷却的水，溶解并定容至刻度。混匀备用。
    3.2 维生素B6标准贮备溶液
　　称取40mg（中国药典参照标准）维生素B6，或复合维生素（中国药典参照标准）B640mg，B1100mg，B250mg（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，加水溶解定容至刻度，此液1mL含400μg的维生素B6。
    3.3 维生素B6标准工作溶液
　　吸取（3.2）贮备液1mL于100mL容量瓶中加水稀释至刻度，混匀，此液1mL含4μg的维生素B6。

    4 仪器设备
    4.1 荧光分光光度计；
    4.2 分析天平：感量0.0001g。
    4.3 实验室用器皿
　　容量瓶 1000mL，100mL，50mL，25mL。
　　刻度移液管 10mL，5mL，1mL。

    5 分析步骤
    5.1 试样的选取和制备
　　选取有代表性的试样，粉碎通过0.28mm孔筛，用四分法缩减至100g，密封保存，以防试样维生素B6变化或变质。
    5.2 测定步骤
    5.2.1 维生素B6的提取
　　称取试样（配合饲料，浓缩饲料，预混合饲料）0.5～2g，（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，加水溶解后，定容至刻度，振荡1～2min，静置待沉清，或离心（400r/min）10min。
    5.2.2 试样的测定
　　移取试样的上清液1mL（≤40μgVB6）于25mL容量瓶中，加入（3.1）pH7缓冲液至刻度，混匀，用1cm石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激发波长326nm、发射波长395nm测定其荧光强度。
　　同时做空白试验。
    5.2.3 工作曲线的绘制
　　取0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50mL维生素B6标准工作液（3.3）分别于25mL容量瓶中，加入pH7缓冲液（3.1）至刻度，混匀，用1cm石英比色杯，置入荧光分光光度计内，于激发波长326nm、发射波长395nm测定其荧光强度，以荧光强度为纵坐标，维生素B6量为横坐标，绘制工作曲线。

    6 分析结果计算和表述
　　维生素B6的含量（mg/kg）按下式计算：

    VB6（mg/kg）＝M×D/W×（1000/1000）＝M×D/W

    式中：M──
    工作曲线上查得维生素B6含量，μg/mL；

    W──
    试样的质量，g；

    D──
    试样的总体积，mL。

    7 允许差
    7.1 每个试样称取两份平行测定，取算术平均值为测定结果并保留两位小数。
    7.2 维生素B6含量少于40mg/kg以下，平行测定结果相对差值不大于10％，维生素B6含量大于40mg/kg的平行测定结果相对差值不大于5％。