饲用纤维素酶活力测定方法的探讨

饲用纤维素酶作为新型饲料添加剂，在饲料工业中应用已相当普及，对其质量检测显得日益重要，但在国家饲料工业标准中，尚未见有纤维素酶活力的测定方法。据研究所知纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用，一般称为G1酶；一部分是对羧甲基纤维素钠（Na－CMC）水解能力区分，称为C1酶；针对上述情况，一般采用两种测定方法，一种是CMC法，适用于Cx酶；另一种是滤纸法，则适用于C1酶活力的测定。 1 CMC（羧甲基纤维素）法 1．l 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。 1．2 主要试剂 磷酸氢二钠（AR）；柠檬酸（AR）；羧甲基纤维素钢（AR）； 3，5－二硝基水杨酸（AR）；氢氧化钠（AR）；酒石酸钾销（AR）；亚硫酸钠（AR）；苯酚（AR）。 1．3 主要仪器 721型分光光度计；恒温水浴锅；PHS-2型酸度计；秒表。 1．4 试剂配制 1．4．1 pH5．0柠檬酸缓冲液 1．4.1.1 0．2mol／l磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H20）液称取7．16g磷酸氢二钠，溶解于蒸馏水中，定容至100ml。 l．4.1.2 0．lmol／l的柠檬酸（C6H8O7·H2O）液 称取2．10g柠檬酸，溶解于蒸馏水中，定容至100ml。 取A 24．3ml，B 25．7ml混匀，用精密酸度计测至pH值为5．0。 l．4.2 羧甲基纤维素钠溶液 准确称取2．00g羧甲基纤维素钠溶于200ml水中，沸水浴中加热至溶化，过滤，取滤液100ml，加柠檬酸缓冲液20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮存于冰箱中备用。 l．4．3 3，5一二硝基水杨酸显色液 准确称取6．30g 3，5－二硝基水杨酸，置于ZN氢氧化钠262ml溶液中，然后加酒石酸钾钠的热溶液（182．0g酒石酸钾销溶于500ml水中），再加 5．0g苯酚和5．0g亚硫酸钠，搅拌至溶解，冷却后定溶至1000ml，贮存于棕色瓶中，冰箱中备用。 1．4.40．L%标准葡萄糖溶液 精确称取经105％℃烘至恒重的无水葡萄糖250 .0mg，溶解于蒸馏水中，定容至250ml。 1．5 标准曲线的绘制 分别吸取0．l％标准葡萄糖溶液2．0ml、4 oml、6．0ml、8．0ml、 10． 0ml，分别定容至50ml。再分别吸取上述溶液各2．5ml于试管中，各加 2．5ml 3，5一二硝基水杨酸显色液，煮沸5min（另作一管对照，取2．5ml蒸馏水，2.5ml 3，5一二硝基水杨酸，同样煮沸5min）。冷却后，用721型分光光度计，在530nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 1．6测定方法 l．6.1 酶液制备 通过"四分法"精确称取酶样品2.00g，加温水90ml，柠檬酸缓冲液10ml，40℃浸提1h，以脱脂棉过滤备用。 1.6.2 根据酶活高低，上述酶液需适当稀释，使其产生的还原糖在100μg－50Cμg之间，光密度在0．l－06。 l．6．3样品测定 取 1支小试管（15mm×150mm），加羧甲基纤维素钠溶液2．0ml，于50℃水浴中热2min～3min，加稀释酶液0．５ml，保温30min，取出立即加入3，5一二作同样品测定. 1．7 计算 CMC酶活力单位﹦B× n／0． 5 mg／g· 30min· 50℃式中： B－－从标准曲线中查得的净葡萄糖毫克数， mg； n--酶液稀释倍数； 0．5--测定时吸取稀释酶液毫升数，ml。 2　滤纸法 ２．１　试剂醋酸钠（AR）；冰醋酸（AR）；甲苯（AR）；氢氧化钠（AR）；酒石酸钾钠（AR）；苯酸（AR）；亚硫酸钠（AR）；3，5－二硝基水杨酸（AR）；新华5号滤纸。 2．2　主要仪器　同CMC法。 2.3 试剂配制 2.3．1 0．lmol／l PH4．6醋酸一醋酸钠缓冲液 准确称取醋酸钠（CH3COONa·3H2O）6．70g和冰醋酸2．60ml，以蒸馏水溶解，定容至1000ml。 2.3．2 3，5一二硝基水杨酸显色液配制同CMC法。 2． 3 .3 新华 5号滤纸剪成1cm× 3cm纸条。 2.4 标准曲线绘制 同CMC法 2．5测定方法 2.5．l酶液制备 同CMC法 2．5．2样品测定 精确吸取4．0ml酶液和l．0ml缓冲液于试管中，加入新华5号滤纸条一条，滴入甲苯2～3滴防腐，40℃静止反应24h。吸取滤纸酶解液 1．0ml，加蒸馏水1．5ml，加 3，5－H硝基水杨酸溶液2．5。ml于试管中，沸水浴煮沸5min，冷却后在530um处测定光密度OD值。 2．5．3 空白测定 吸取40ml蒸馏水代替4．0酶液，其它操作同样品测定。 2．6计算 滤纸酶活力(FB）＝Bn／4／5 ×1 mg／g· 24h·40℃ 式中：B－－从标准曲线上查得的净葡萄糖毫克数，mg； n--酶液稀释倍数； 4／5--５ml反应液中含4ml酶液； １--吸取lml酶解液进行测定。 3 讨论 作为底物的羧甲基纤维素钠，滤纸生产厂家不同，测定酶活时，结果不相同，有时相差也较大。因此，得出酶活力结论时，应注明底物产地。纤维素酶是一种微生物活性制剂，它对温度，酸度十分敏感，不同菌株生产的纤维素酶最适作用pH值，最佳作用温度有所不同，测定方法有待进一步探讨。