锌指核糖核酸酶

       锌指核酸酶（ZFNs），ZFNs由一个DNA识别域以及一个DNA剪切域组成。DNA识别域为3～4个ZF串联结构，每个ZF约含30个氨基酸，被1个锌离子所固定，可识别并结合1个特异的三联体碱基，其二级结构为alpha-beta-beta二级结构，骨架结构保守，其中a-螺旋的-1、-6氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，而这类氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。DNA剪切域由非特异性核酸内切酶Fok I 羧基端的96个氨基酸残基组成。每个Fok I 单体与1个ZFP相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时（6～8bp），2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。

       现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌​指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp)，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。

      该技术一直以来被Sangamo生物公司所垄断，该公司只与部分科研机构合作。现在这种形势得到了改变，一个由八个实验室组成的协会，在分子生物学家J. Keith Joung的带领下，提出了制造ZFN的一种开源方式(Maeder et al., 2008)。该组织建立了66个“锌指”库，选择性地针对不同的DNA序列。从库中建立的“锌指核酸酶”在测试一个植物基因和三个人类基因时大概有1－50%的高效率，这种效率可以与Sangamo、经典基因立法相媲美

      ZFN技术亦具有潜在的临床应用前景。传统的基因治疗的方式主要有两种，一种是利用病毒携带完整的基因序列送入人体内或者是注入一小段正确的DNA序列来修正错误或者使错误的基因不表现，然而到目前为止，事实上科学家都无法确认这些方法在实际应用上是有效率及安全的。而藉由同源互换的原理使得细胞自行修正错误的DNA序列是发展基因治疗上最基本的原则。这一过程通过两个独立的步骤完成：首先在DNA中引入一个双链断裂，启动细胞自身的修复系统；之后“同源重组”参考引入的相似序列作为模板修复这段基因，从而实现指定部位的碱基替换。

      Urnov et al. (2005)针对一个IL2R基因上的突变而引起严重的免疫不全症 [X-linked severe combined immune deficiency (SCID)] 来设计了四指的ZFN. SCID会使T细胞失去对抗外界入侵及感染的能力，而科学家们结合注入正确的DNA片段及ZFN的方式在培养皿中处理这些SCID的T细胞。利用该系统介导了人类细胞IL2R酌的高效修复。在无选择压力下修复效率达15%~18%，而实际在体内，修正后的细胞比原来的突变细胞具有选择优势，故这样的修复效率已足够用于基因治疗。这样的操作与传统的逆转录病毒等技术相比，具有明显的优势：他没有造成人们所不希望的基因重组的风险，因为它修正错误的序列，而非增加一个正确的拷贝。这给利用ZFN进行基因修复带来希望。 但是ZFN技术用于临床治疗还有很长的路要走。例如，人们不能预期引入的ZFN蛋白是不是会引起免疫系统的进攻。并且至少到目前为止，这样的技术似乎只能用于那些可以从病人体内抽取出来的细胞，对他们进行体外操作，再注回病人体内：直接体内注入基因的效率还太低了。最后，ZFN操作在细胞内到底精确程度如何，也必须小心评估：极少的错误也可能导致产生细胞癌变等严重的后果。