抗猪瘟转基因动物模型

养殖业的发展，使畜禽数量增加，生产性能提高，但畜禽传染病日趋严重，常规防疫措施有时无能为力。为此该研究承担“863”项目，开展了基因工程抗病育种的探索。首选对象是危害最大的猪瘟，采用的技术路线是核酶(Riboayme)阻断病毒基因表达的机制。首先分析我国猪瘟病毒保守基在P80和411个核苷酸(nc)序列，发现我国石门毒与国外毒株在41Int的区段中，同源性高达91．50％～96．60％，并且有20个nt长的区段作为核酶的靶区。针对该靶区设计并合成了核酶基因，构建了体外和体内表达载体，并经酶切和序列测定，证明合成的基因、构建的载体与预期的设计相符。将体外表达的核酶分子与猪瘟病毒RNA混合于试管内作用后，病毒RNA分子被切成了预期的两个片段。体外证明所合成的核酶基因具有活性，将该基因用磷酸钙沉淀法导入PK50传代细胞，获得了抗猪瘟病毒感染能力提高60．2％细胞克隆。经细胞功能验证后，又将含核酶基因的重组质粒用显微注射导入家兔受精卵原核。前后共注射444枚受精卵，移植30只受体兔，获98只后代，经PCR和Southern杂交检测，其中有6只仔兔整合了导入的核酶基因。为了检测转基因兔的实际抗病毒性能，对其中4只接种了100个RID50C株病毒，观察体温反应。结果1只动物体温完全正常，1只仅有0．5℃以下的体温上升，2只温度上升不超过1℃。而对照兔和经过转基因但未整合的兔均有212以上的体温上升，并呈现典型稽留热，说明这4含核菌基因的家兔完全或部分抗住了猪瘟病毒感染。将4只抗病毒转基因兔剖杀，取肝脏用RT―PCR和Northern杂交检测，在2只兔肝细胞中检出了外源基因表达的核酶RNA。进一步佐证了外源基因在兔体内表达并阻断了病毒复制。