基因枪

      基因枪技术, 又被称为生物弹道技术(Biolistic Technology) 或微粒轰击技术(Particle Bombardment Technology),是 用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的组织或者细胞中的一种技术。它是基因转移技术中的一种方法。其基本原理就是采用一种微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨(它们比重大, 而且化学性质都很稳定)颗粒获得足够的动量打入靶细胞或组织。

      基因转移技术是一种将外源基因以在体(in vivo)或离体(in vitro)的方式导入到靶细胞核内的技术, 属于基因工程技术(亦称重组DNA 技术)的一个重要组成部分。基因工程技术以分子生物学等学科发展为基础, 使人类拥有了构造生物遗传物质新组合的能力。
      对在体方式而言, 基因转移技术需要跨越细胞外和细胞内双层障碍。细胞外的转移过程中遇到的障碍有:DNA 在血浆中的降解、网状内皮组织对于DNA的吸收、难以将DNA 定位到特定的器官、转染为黏液所阻止等;细胞内的障碍包括:溶酶体对DNA 的降解作用、DNA 胞浆的稳定性以及DNA 向质粒的移位等。
      基因枪技术等直接转移方法是人们以物理方法来将基因转移的方法。

      基因枪法是一种基因导入仪技术，它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器，是目前国际上最先进的基因导入技术。气体基因枪以压缩气体（氦或氮）转换成的气体冲击波为动力，使气体基因枪枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室，因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤。气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用。气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa，具有相应不同的可破裂膜，将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中（最大靶直径50mm）。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。中科院遗传所、北京大学、浙江大学、西北农林科技大学等有关单位均采用该设备。

      基因枪的历史可以追溯到1987年。
       第一代基因枪是台式基因枪，其中火药型台式基因枪是基因枪中最原始的类型。最早的基因枪是由美国康奈尔大学Sanford于1987年与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。该方法一经发明便在学界崭露头角，Klein等人于1987年最早应用基因枪进行洋葱表皮细胞的转化，并获得了成功。
       基因枪自1987年诞生以来得到迅速发展。美国康乃尔大学自1988年先后申报了三个关于基因枪技术的专利（EP 0331 855A2，1988：US Patent Number 4，945，050 July 31，1990：US Patent Number 5，036，006 July 30，1991）。1987-1990年间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。McCabe于1988年将目的基因包于钨粉上，电轰击大豆茎尖分生组织，结果约有2%的组织通过器官发生途径获得再生植株，在子代中检测到了外源基因。1989年气动式基因枪转化烟草等植物获得成功，并且得到了瞬时表达。大麦的转基因技术比起其他植物相对发展速度较慢，直到1989年，Kartha等人用大麦的细胞和组织进行培养，成功检测到报告基因的瞬时表达。
      1990年，美国杜邦公司(DuPont Company)推出首款商品基因枪PDS-1000系统。该仪器是一种“biolistic”台式基因枪,有关的工艺技术是从一个小型的Biolistics公司(负责人来自康乃尔大学)购买的。据康乃尔研究基金会副主席和大学专利及技术市场的负责人W.Haeussler说,向杜邦公司转让的这个技术是当时康乃尔发明的一次最大交易,将总数228万美元的专利税和研究支持费一次性付给康乃尔大学。当时由伯乐公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)与杜邦签署的的代工与分销商协议。随后，伯乐公司1992年推出了PDS-1000/He枪。国内中国科学院生物物理所和清华大学也分别于1989年和1991年推出了新的枪种并申请了专利（中国专利89109334和91207467）。与现在新型手持型基因枪不同，台式基因枪体积偏大，实验场所受限，不能灵活应用于田间地头。高压气体需要抽真空，压缩机工作时噪音较大，而且过高气压推动微粒子轰击使得台式基因枪仅限于细胞转殖而不能用于活体转殖。第一代基因枪的每枪轰击成本也很高，金粉与控制气压用的Rapture disk均造价不菲。
       第二代基因枪出现于1996年，伯乐公司推出了Helios手持式基因枪。这是历史上最早出现的手持式基因枪。该系统通过可调节的氦气脉冲，来带动位于小塑料管内壁处预包有DNA、RNA 或其它生物材料的金粉颗粒，将其直接打入细胞内部。与第一代台式基因枪相比，Helios手持式基因枪摒弃了抽真空压缩机，牺牲了一些气体压力，从而使活体动物转殖成为可能，可以对活体动物的肌肉、皮肤直接进行转殖。因其体积小巧，方便实验人员随身携带，大大地拓宽了基因枪的应用范围。在随后的10年里，Helios手持式基因枪被广泛应用于由原生质体再生植株较为困难和农杆菌感染不敏感的单子叶植物的基因转殖。在基因枪以前，外源DNA进入细胞质后很难穿过双层膜的细胞器。用基因枪技术转化这类细胞器，转化频率高，重复性好，是目前该领域研究中最常用和最有效的DNA导入技术。相比较第一代台式基因枪而言，手持式基因枪由于气体压力较小（仅有100-600 psi），而不能穿透成熟叶片的细胞壁，一定程度上影响了其在植物中转基因的应用范围，不过与台式基因枪互补，Helios很好地延伸了基因枪的应用领域。
       同样是利用高压气体传送基因，制作技术的改良使得基因枪从细胞转殖到活体转殖，从台式到手持，一步一步将基因枪的应用范围扩大。首先意识到并积极尝试利用基因枪的生命科学工作者在转基因工作中的科研水平得到了极大提高，转基因工作者的想象力也因此得到了解放。蒸蒸日上的基因枪技术被学界寄予厚望，视为转基因领域的明日之星。不过慢慢地人们发现，活体动物的脏器相比于皮肤、肌肉要脆弱得多，如小鼠活体的肝和脾最多只能承受40psi的压力，在100psi的高压气体冲击下器官会被严重破坏而导致实验失败。而过低的气体压力并不能令基因微载体具有足够的动量打入细胞内部。气体压力与粒子传递速度的矛盾成了基因枪发展的瓶颈，这个问题在之后的10年一直困扰着各大生命科学仪器厂商的研发团队。
     直到2009年，Wealtec公司推出GDS-80低压基因传递系统（又称：GDS-80基因枪）（US Patent Number 6,436,709 B1），引领了第三代基因枪技术发展方向。

GDS-80基因枪

GDS-80手持式基因枪巧妙地从流体动力学与航空动力学入手，使用氦气或氮气于低压状态加速生物分子至极高的速度，完成基因传送，从一个全新的角度解决了气压与粒子速度的矛盾。第三代基因枪的超低压（10-80 psi）推动，不仅没有牺牲反而大大增加了微粒子的传输动量， GDS-80基因枪 此不仅使基因枪能够成功应用于仅在低压状态下才能完成的动物活体器官层面转殖；而且相比较于第二代手持式基因枪，GDS-80射出的携基因微粒子因为其本身的高动量，居然能够像台式基因枪发射出的粒子一样穿透植物细胞壁穿入植物细胞完成转殖，而在此之前，完成这一工作的第一代台式基因枪需要至少1000-2000psi的高压气体。在动物细胞，尤其是活体动物转殖实验中，本身具备高动量的生物粒子毋需借由微粒子载体(如金粒子)的携附方式转移至目标体中，这在避免了靶细胞内异物残留问题的同时，大大降低了实验成本。第三代基因枪的低压传导，使得细胞损害与枪体轰击的噪音都大大减少，并有效地在动物实验中降低了由金粉微载体带来的昂贵开销。GDS-80基因枪“子弹”的制备也从干式转为湿式，节省了烘干的时间，简化了流程。

      在迄今发展起来的棉花转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化应用最为广泛。自1987年Umbeck等通过农杆菌介导法成功获得坷字棉转基因植株后，农杆菌介导法逐渐成为国际上最普遍的转化手段，并且取得很大进展。中国农科院棉花研究所成功建立了20多个棉花品种的高效、稳定的规模化转化体系，实现了流水线操作，建立了高效、工厂化的棉花转基因技术体系。尽管农杆菌介导法是理论和实践都较为完善的一种转化技术，且已被广泛用于双子叶植物的转化，但该方法受宿主基因型范围的限制，很多优良品种(系)很难以此法进行转化，并且转化程序烦琐复杂。花粉管通道转化法虽然没有基因型、种属控制，但其转化技术不太完善，对转化机制缺乏系统的研究，常局限于开花期才能应用。因此，需要发展出有效的基因转化方法。

       中国农业科学院棉花研究所叶武威等人在2013年开发出一种棉花的基因枪活体快速转化方法，通过第三代便携式基因枪和优化转化的参数使活体转化时对花蕾和花粉形成微创伤，大大缩短了获得转基因植株的周期。该方法包括如下步骤:(1)利用基因枪轰击的方法，将含有外源基因的载体轰入父本棉花的花粉中;(2)将基因枪轰击后的父本花粉授粉到活体母本棉花中;(3)授粉后的母本棉花所结的种子便是转基因棉花种子，实现了棉花的基因转化。此方法无需组织培养步骤，直接在活体棉花上便实现基因转化，实用、易操作、不依赖组织培养、稳定性好。